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| 摘要 目的 寻找适合黑素细胞移植治疗白癜风的黑素细胞培养方法。方法 以黑素细胞培养基培养黑素细胞，培养7天后倒置显微镜观察黑素细胞形态，并测定酪氨酸酶活性和黑素含量。结果 培养的黑素细胞具有较多的树突且明显延长。结论 以黑素细胞培养基培养黑素细胞具有较多的树突且明显延长,适用于移植治疗白癜风的黑素细胞培养。 关键词 黑素细胞 白癜风 培养 形态 Study of human melanocytes in cultured conditions LI Daning, FENG Xinqing (Department of Dermatology, Xuhui Central Hospital, Shanghai 200031,China) Abstract Objective To explore a cultured the methodf of human melanocytes for cell transplantation.Met-hods Melanocytes isolated with routine method were cultured in medium.Morphology were observed by invert microscope.Activity of tyrosinase and syntheses of melanin were evaluated after 7d of culture.Results Melano-cytes cultured had more longer dendrite,activitity of tyrosinase.Conclusion Melanocytes cultured in medium had longer dendrite.It may be applied for cell transplantation. Key words Melanocyte；Culture；Morphology 白癜风是一种常见多发的色素性皮肤病。虽不影响患者正常的生理活动，但因影响美容，给患者造成心理和精神的负担和痛苦是巨大的。目前，培养黑素细胞移植治疗白癜风已应用于临床，故为移植治疗提供合适的培养细胞来源倍受关注。本实验观察培养状态下黑素细胞形态特点，并探讨了黑素细胞形态和功能的相互关系，摸索了一种适合黑素细胞移植治疗的黑素细胞培养方法。 1 材料和方法 1.1 材料 MCDB 153培养液(SIGMA公司)，NaHCO31.2g，TPA 8nmol，霍乱毒素0.4g，IBMX 0.1nmol,胰岛素5.0mg，氢化可的松1.0mg，青霉素400u/ml，链霉素100ug/ml，表皮生长因子(EGf)、牛垂体浸液(BPE)、碱性成纤维细胞生长因子(B-FGF)为GIBCO公司产品，MTT为SIGMA公司产品。 1.2 方法 环切术切除的包皮，立即放入75%酒精漂洗，随即放入含双抗的D-Hanks液中，存放于低温环境。将包皮用含双抗的D-Hanks液和不含双抗的D-Hanks液再各漂洗一遍。将表皮正面向上平铺于含2层纱布已预冷的培养皿内，加0.25%胰酶于纱布上，置于4度冰箱进行消化过夜。12小时左右,将已消化过的皮肤进行表真皮分离,分离下的表皮放于MCDB 153培养液中。用吸管反复吹打至培养液浑浊。真皮面用镊子轻刮。以后步骤相同。过150目筛去除杂质。计数，离心,加液,调整浓度至5×106/L接种至培养皿内,置于含5%CO2 37℃的恒温箱内。24h首次换液。以后2天换一次液，至瓶内细胞铺满于瓶底，即换代。换代过程：吸除培养液，0.25%胰酶1ml流经细胞表面,1分钟后即吸除。置于37度培养箱内，约半分钟取出观察，看有突树回缩现象，即加含牛血清的培养液终止消化，并吹打使细胞脱离瓶壁，收集培养液。未消化完的，用D-hanks液清洗2遍，重复消化、计数，、离心，调整密度至5×106/L接种。接种于96孔培养板，隔天换液。形态观察：于培养第5d倒置显微镜下观察培养黑素细胞的形态，比较树突数量及树突长度。 2 结果 黑素细胞形态观察，黑素细胞表现为双极或三极细胞，多极细胞明显增多，黑素细胞树突明显延长，数量明显增加，细胞轮廓较明显。 3 讨论 白癜风为局部或泛发性色素脱失，表皮明显缺少黑素细胞和黑素颗粒。病理上基底层缺乏多巴染色阳性的黑素细胞。黑素细胞的主要功能是合成黑素，通过树突将黑素颗粒输送给其相联系的角质形成细胞，使皮肤维持正常颜色。黑素细胞树突的生长受多种因素调控，细胞因子、角质形成细胞与黑素细胞的细胞—细胞间连接均可调节黑素细胞树突的生长。树突的形成是黑素细胞形态分化的表现,缺乏树突则是黑素细胞分化不良的表现，形态的变化反映了细胞的功能状态。传统方法培养的黑素细胞表现为缺乏树突的形成，形态类似培养的成纤维细胞，与在体条件下表皮黑素单位中黑素细胞形态差异很大。本实验采用的培养黑素细胞方法，待黑素细胞贴壁后，黑素细胞表现为双极、三极和多极的树突状，形态接近在体的黑素细胞。双极或三极细胞为黑素细胞的增殖状态，而多极细胞是黑素细胞的功能状态。因此，该培养方法是一种较理想的体外研究黑素细胞的培养方法，尤其在研究黑素细胞树突及黑素运输方面具有优势。目前，培养的黑素细胞移植治疗白癜风己应用于临床，将可能成为黑素细胞移植治愈白癜风理想的方法。 参考文献 1 Seiberg M.Pigment Cell Res,2001,14:236-242 2 Abdel-Naser MB.Br J Dermatol,1999,140:50-55 3 Kippenberger S,Bernd A,et al. Pigment Cell Res,1998,11:34-37 |
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