平行的激光束通过光束分离器后进入目镜，目镜采集到部分球状散射的荧光释放光并使这些光成为平行的光束，此外还采集被反射的激光，这些激光的强度要比荧光强度大3-7倍。采集回来的光束再次通过光束分离器，光束分离器将大部分激光反射回激光源处，并允许大部分荧光束通过光束分离器，一面平面镜将荧光束反射到释放光栅处，光栅选择很窄范围波长的光通过，并将剩余的激光激发光全部反射回去。共聚焦的工作特点体现在探测目镜和开了一个针孔大的孔的光线挡板上，探测目镜将平行光聚集为很小直径的一束光之后，挡板上的小孔只允许聚焦的光线通过并将其余的光遮挡住。

    若发光点不在目镜焦点范围内，则光线将被探测目镜聚集于挡光板前，散射之后大部分光线被遮挡了，只有焦点范围内的光线才能有效地进入当光板的小孔被探测器检测到。对焦距范围的严格限制使得灰尘或近表面的小颗粒均不能成像被探测到，因而共聚焦扫描仪获得图象的信噪比要高于非共聚焦扫描装置。但另一方面，对焦距范围的严格限制要求载玻片摆放非常平稳，扫描运动过程中载样盒要保持在同一水平面上，偏差要小于焦距的范围，偏差小于±10mm。这一要求增加了机械加工的精密度，使得加工工艺更加复杂，但这是保证获得最佳图象质量的有效途径之一。